TLR4のノックアウトは慢性脊髄損傷におけるサイトカインおよび細胞外マトリックスの発現を調節し、二次的損傷と機能回復を改善させる

生物学の基礎

以下の文章を校正いたしました。

RIPK3、MLKLを調べている理由

RIPK3とMLKLを調査している理由は、これらがネクロプトーシスと呼ばれる細胞死の経路に関与しているためです。ネクロプトーシスは炎症性の細胞死の一形態であり、脊髄損傷後の炎症反応や細胞死において重要な役割を果たす可能性があります。

具体的には、RIPK3のリン酸化がMLKLを活性化し、MLKLが細胞膜に移動して細胞膜の破壊を引き起こします。これにより、細胞が死ぬだけでなく、損傷関連分子パターン（DAMPs）が放出され、さらにTLR4を介した炎症反応が続くことになります。

本研究では、脊髄損傷後にTLR4の欠損がこのネクロプトーシス経路に与える影響を評価することで、慢性的な炎症と二次的損傷を軽減し、神経保護や機能回復を促進する可能性があることを示しています。

RIPK3とMLKLのTLR4との関連

RIPK3とMLKLがTLR4と関連している理由は、TLR4がこれらの分子を介してネクロプトーシス経路を制御する可能性があるからです。

TLR4は炎症反応を引き起こす重要な受容体であり、脊髄損傷後の慢性炎症に関与しています。RIPK3とMLKLは、TLR4が活性化されることで誘導されるネクロプトーシス経路における中心的な分子です。この経路では、TLR4のシグナル伝達がRIPK3のリン酸化を促進し、さらにMLKLの活性化を引き起こします。活性化されたMLKLは細胞膜に移動し、細胞膜の破壊を通じて細胞死を誘導します。

本研究では、TLR4の欠損がRIPK3とMLKLの活性を抑制し、結果的にネクロプトーシスを減少させ、慢性炎症を抑制することが示されています。これにより、神経やミエリンの損失が軽減され、運動機能の回復が促進されることが確認されました。

この研究でTLR4に注目した理由

この研究でTLR4に注目した理由は、TLR4が脊髄損傷後の炎症反応において重要な役割を果たしているためです。具体的には、TLR4は炎症性サイトカインの産生や細胞外マトリックス（ECM）の変化を引き起こし、これが二次的な組織損傷や機能障害を悪化させる可能性があるためです。

背景としての問題意識

脊髄損傷後、初期の急性期には局所の組織損傷が発生し、それに続く二次的な炎症反応が長期にわたって持続します。この慢性的な炎症反応が神経組織の再生を阻害し、回復を妨げる要因となっています。

TLR4の役割

TLR4は、炎症を引き起こすパターン認識受容体として、外来の病原体や内因性の損傷関連分子（DAMPs）を認識します。脊髄損傷後には、TLR4が過剰に活性化され、慢性炎症や細胞死が誘発されることが示唆されています。

研究の目的

本研究の目的は、TLR4が慢性期の脊髄損傷において炎症反応や細胞死にどのように関与し、それが二次的損傷や機能回復にどのような影響を与えるかを解明することです。これにより、TLR4を標的とした新しい治療法の開発が期待されています。

脊髄損傷慢性期におけるTLR4の発現細胞

脊髄損傷慢性期（8週間後）において、TLR4を発現している細胞は以下の順に多いです。

  1. アストロサイト（GFAP陽性細胞）
    TLR4は慢性期において特にアストロサイトで強く発現しており、時間が経過するにつれてその発現量がさらに増加します。
  2. マクロファージ/ミクログリア（CD11b陽性細胞）
    マクロファージやミクログリアでもTLR4の発現が確認されていますが、慢性期ではその発現はアストロサイトほど強くなく、7日目に比べて減少しています。
  3. ニューロン（NeuN陽性細胞）
    ニューロンではTLR4の発現はほとんど見られません。

このように、脊髄損傷後の慢性期では、TLR4は主にアストロサイトで高く発現しており、これが炎症や組織再構築に関与していると考えられます。

CC1陽性細胞とは？

CC1陽性細胞はオリゴデンドロサイトを指します。オリゴデンドロサイトは中枢神経系（CNS）においてミエリン鞘を形成する細胞で、ニューロンの軸索に絶縁を提供し、神経信号の伝達速度を向上させる役割を担っています。

CC1はオリゴデンドロサイト特異的なマーカーとして広く使用されており、オリゴデンドロサイトの識別や数の定量に利用されます。脊髄損傷後の研究では、オリゴデンドロサイトの数や機能が神経再生や回復において重要であるため、CC1陽性細胞の解析が行われます。

TLR4-KOのオフターゲット効果

TLR4-KOマウスを使用する際のオフターゲット効果として考えられる点は以下の通りです。

  1. 他のTLRファミリーとの交差反応
    TLR4はTLRファミリーに属する受容体であり、他のTLR（TLR2、TLR3など）との間でシグナル伝達経路が重複している可能性があります。TLR4が欠損すると、他のTLRが補償的に活性化される可能性があり、これが観察される効果に影響を与える可能性があります。
  2. 炎症応答の全体的な抑制
    TLR4は炎症応答の主要な調節因子であるため、その欠損により全体的な免疫反応が抑制される可能性があります。この結果、TLR4に直接依存しない炎症や免疫応答も影響を受け、異常な結果を引き起こすことがあります。
  3. 代謝や他の細胞機能への影響
    TLR4は炎症応答以外にも細胞代謝や生存シグナルに関与しているため、TLR4の欠損が代謝経路や細胞の基本的な機能に影響を与える可能性があります。これにより、脊髄損傷以外の背景でのオフターゲット効果が生じることがあります。
  4. 遺伝的背景の影響
    TLR4-KOマウスは特定の遺伝的背景を持つため、他の遺伝子との相互作用により、想定外の生物学的効果が現れることがあります。特に、バッククロスが不完全である場合、背景遺伝子の影響が顕著になる可能性があります。

これらのオフターゲット効果は、TLR4欠損に起因する観察結果が必ずしもTLR4そのものによるものではない可能性があることを示唆しています

。そのため、結果の解釈には慎重を要し、他の方法（例：コンディショナルノックアウト、TLR4阻害剤の使用）を用いて結果を検証することが望ましいです。

mRNA抽出とRNAシークエンスの場所

この研究では、脊髄損傷部位からmRNAを抽出してRNAシークエンシング（RNA-seq）を行っています。具体的には、損傷の中心部（エピセンター）を含む約5mmの脊髄組織を損傷後7日目と8週間目に採取し、その組織からmRNAを抽出しています。この手法により、損傷部位における遺伝子発現の変化を詳細に解析し、TLR4の欠損が脊髄損傷後の炎症反応や細胞外マトリックス（ECM）関連遺伝子にどのように影響を与えるかを調査しています。

scRNA-seqの有無

この研究では、scRNA-seq（シングルセルRNAシークエンシング）は行っていません。使用されているのはRNA-seqであり、これは脊髄損傷部位から抽出した全組織のmRNAを対象にしています。

RNA-seqは組織全体の遺伝子発現を調べる手法であり、scRNA-seqのように個々の細胞レベルでの遺伝子発現の違いを解析するものではありません。そのため、この研究では個々の細胞タイプごとの詳細な遺伝子発現パターンを解析しているわけではなく、脊髄損傷後の全体的な遺伝子発現の変化を把握しています。

Fig 4の解説

Figure 5は、TLR4欠損（TLR4 KO）マウスと野生型（WT）マウスにおける、脊髄損傷後のNFκBシグナル伝達および炎症性サイトカイン/ケモカインの発現を比較した図です。この図では、主に以下の点が示されています。

NFκBシグナルの活性化

  • Fig 5A, B:
    TLR4 KOマウスとWTマウスで、NFκB-P65の核内移行が比較されています。NFκB-P65は、NFκB経路の中心的な転写因子であり、炎症応答を制御します。TLR4 KOマウスでは、脊髄損傷後のNFκB-P65の核内移行が抑制されており、WTマウスに比べてNFκBシグナルの活性化が低いことが示されています。
  • Fig 5C, D:
    IκBαのリン酸化（p-IκBα）とその分解によりNFκBが活性化される過程が示されています。TLR4 KOマウスでは、WTマウスに比べてp-IκBα/IκBα比が低く、NFκBの活性化が抑制されていることが確認されます。

炎症性サイトカインとケモカインの発現

  • Fig 5E-H:
    IL-1β、TNFα、IL-6、CCL2などの炎症性サイトカインおよびケモカインのmRNA発現レベルが示されています。WTマウスでは、これらの炎症性分子の発現が脊髄損傷後に増加しますが、TLR4 KOマウスではその発現が有意に抑制されています。これにより、TLR4が炎症反応の強化に寄与していることが示唆されます。

まとめ

Figure 5は、TLR4が脊髄損傷後の炎症応答において重要な役割を果たしていることを示しており、TLR4の欠損がNFκBシグナル伝達の抑制とそれに伴う炎症性サイトカインやケモカインの発現低下をもたらすことを明らかにしています。これにより、TLR4を標的とした治療が、脊髄損傷後の慢性炎症の制御に有効である可能性が示唆されています。

t-SNEフローサイトメトリー解析とは？

t-SNE（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding）フローサイトメトリー解析は、多次元データを2次元または3次元の空間に視覚化するための手法です。特に、フローサイトメトリーデータの解析において、複雑な細胞集団のパターンやサブセットを見つけるために広く使用されています。

具体的な手法について

  • フローサイトメトリー:
    フローサイトメトリーは、細胞の物理的および化学的特性を測定する技術で、細胞のサイズ、形状、表面および内部の分子の発現など、多数のパラメータを同時に測定できます。
  • t-SNEの原理:
    t-SNEは、次元の高いデータを低次元空間にマッピングするための非線形手法です。元のデータ空間における類似性を維持しながら、データポイントを2次元や3次元のプロットに配置します。この手法により、類似した細胞が近くに集まり、異なる細胞集団が遠くに配置されるようになります。

t-SNEフローサイトメトリー解析の応用

この手法をフローサイトメトリーに適用することで、複数のパラメータに基づいて細胞集団の複雑な関係性を視覚的に解析できます。具体的には、細胞表面マーカーや内部マーカーの発現に基づいて、異なる免疫細胞のサブセットを識別し、その動態を詳細に評価することが可能です。

この研究におけるt-SNEフローサイトメトリー解析の役割

この研究では、t-SNEを用いたフローサイトメトリー解析により、脊髄損傷後のTLR4欠損マウスと野生型マウスの免疫細胞の多様性や動態を視覚化し、細胞集団ごとの違いや変化を詳細に解析しています。これにより、TLR4が損傷後の免疫応答に与える影響をより深く理解することが可能になります。

使用された抗体

この研究で使用されているフローサイトメトリー（FCM）解析においては、免疫細胞の識別と特性評価のために、以下の抗体が使用されています。これらの抗体は、特定の細胞表面マーカーや内部マーカーを検出するために設計されています。

使用されている抗体のリスト

  • CD45 (BUV395, 1:300, BD Biosciences):
    全ての白血球（免疫細胞）を識別するための抗体。
  • CD11b (BV421; 1:300; BD Biosciences):
    マクロファージやミクログリアなどの骨髄系細胞の表面に発現。
  • Ly6G (BUV737; 1:400; BD Biosciences):
    主に好中球を識別するためのマーカー。
  • F4/80 (APC; 1:250; BD Biosciences):
    マクロファージに特異的なマーカー。
  • Ly6C (BV711; 1:300; BD Biosciences):
    単球や一部のT細胞のサブセットを識別。
  • CD11c (BV650; 1:250; BD Biosciences):
    樹状細胞（DCs）のマーカー。
  • MHC-II (FITC; 1:300; BD Biosciences):
    抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞、B細胞など）の表面で発現。
  • iNOS (PerCP; 1:250; BD Biosciences):
    一酸化窒素合成酵素の誘導型（炎症性のマクロファージや他の

細胞で発現）。

  • ArgI (PE; 1:200; BD Biosciences):
    アルギナーゼI、M2型マクロファージのマーカー。
  • CD206 (PE-Cy7; 1:350; BD Biosciences):
    M2型マクロファージや樹状細胞の表面に発現。
  • CD19 (BV605; 1:250; BD Biosciences):
    B細胞のマーカー。
  • CD3 (AF700; 1:200; BD Biosciences):
    全てのT細胞の表面マーカー。
  • CD4 (APC-Cy7; 1:200; BD Biosciences):
    ヘルパーT細胞のマーカー。
  • CD8 (PE-Dazzle594; 1:250; BD Biosciences):
    キラーT細胞のマーカー。
  • Live/dead UV (1:1,000; BioLegend):
    死細胞と生細胞を区別するための染色。

これらの抗体を使用する目的

これらの抗体は、異なる免疫細胞のサブセットを識別し、それらの動態や特徴を詳細に分析するために用いられています。具体的には、TLR4欠損マウスと野生型マウスにおける脊髄損傷後の免疫応答の違いを明らかにするために、これらの抗体が使用されています。

同時に計測できるか？

通常、フローサイトメトリー（FCM）では、複数の抗体を同時に使用して、さまざまな細胞表面マーカーや内部マーカーを一度に測定することが可能です。このプロセスは「マルチカラー フローサイトメトリー」と呼ばれます。しかし、同時に測定できる抗体の数は、使用するフローサイトメーターの性能に依存します。

具体的には：

  • フローサイトメーターのレーザーと検出器の数:
    典型的なフローサイトメーターは複数のレーザーと検出器を備えており、それぞれ異なる波長で蛍光を励起し検出できます。各抗体は異なる蛍光色素（フルオロフォア）で標識されており、それぞれが特定のレーザーで励起され、異なる波長で発光します。
  • スペクトルオーバーラップ:
    使用する抗体の数が増えると、蛍光色素間でのスペクトルオーバーラップが問題になることがあります。この問題を軽減するため、蛍光補正（compensation）が必要です。
  • パネルデザイン:
    効果的なパネルデザインにより、複数の抗体を同時に使用することができます。この研究で使用されている抗体セットは、多くのフローサイトメーターで同時に測定可能です。

まとめ

この研究で使用されている抗体の数は、マルチカラー フローサイトメーターを使用すれば同時に測定することが可能です。ただし、実際の同時測定可能な数はフローサイトメーターの仕様に依存します。最新のフローサイトメーターでは20種類以上の抗体を同時に測定することも可能ですが、それに合わせた適切なパネルデザインと補正が必要となります。

ECMとして調べた分子

この研究では、TLR4欠損マウスと野生型マウスにおける脊髄損傷後の細胞外マトリックス（ECM）関連分子の発現を解析しています。具体的に調べたECM関連分子は以下の通りです。

  • Versican:
    ECMにおける大きなプロテオグリカンで、細胞接着や移動、細胞間シグナル伝達に関与します。
  • Lumican:
    小型のリポポリ糖タンパク質であり、コラーゲンの形成や細胞の遊走に関連しています。
  • Phosphacan (PTPRZ):
    神経組織に多く存在し、細胞外領域でシグナル伝達に関与するプロテオグリカン。
  • Decorin:
    小型のプロテオグリカンで、コラーゲン線維との相互作用を介して、組織の構造と機能を調整します。
  • Collagen 1A1 (COL1A1):
    コラーゲンの主要構成成分であり、組織の強度と柔軟性を提供します。
  • Matrix Metalloproteinase-9 (MMP9):
    ECMの分解に関与し、損傷後の組織リモデリングに重要な役割を果たします。

研究の目的

これらのECM分子を調べることで、TLR4欠損がECMのリモデリングや、損傷後の組織再生にどのように影響するかを評価しています。特に、ECMの変化は、脊髄損傷後の神経再生や二次的損傷の進行に深く関与しており、TLR4がこれらのプロセスにどのように影響を与えるかを理解するために重要です。

Collagen1の結果

この研究におけるCollagen 1A1 (COL1A1)の結果は、TLR4欠損マウス（TLR4 KOマウス）と野生型マウスの脊髄損傷後における発現の違いを調べたものです。

結果の概要

TLR4 KOマウスでは、脊髄損傷後8週間でCollagen 1A1の発現が野生型マウスに比べて低下していることが示されました。この結果は、TLR4がECMのリモデリングやコラーゲンの蓄積に寄与していることを示唆しています。特に、TLR4の欠損によって、ECM分子の異常な蓄積が抑制され、炎症性反応や瘢痕形成が軽減される可能性があります。

具体的なデータ

Western blotやmRNA解析において、TLR4 KOマウスではCOL1A1の発現レベルが野生型マウスよりも有意に低下していることが示されました。これにより、TLR4が慢性期の脊髄損傷後のコラーゲン蓄積に重要な役割を果たしていることが明らかになっています。

意義

COL1A1の発現低下は、TLR4欠損が組織の過剰な瘢痕形成を抑制し、神経再生や機能回復を促進する可能性を示唆しています。これにより、TLR4を標的とした治療法が、脊髄損傷後の慢性期における治療戦略として有望であることが示されています。

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